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Nov 18, 2023

Der räumliche Transkriptomatlas zeigt die Mikrostruktur der Lunge

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 879 (2023) Diesen Artikel zitieren 144 Zugriffe auf 2 altmetrische Metrikdetails Charakterisierung der Wirtsreaktion auf das schwere Coronavirus mit akutem respiratorischem Syndrom

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 879 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Charakterisierung der Wirtsreaktion auf das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) auf molekularer Ebene ist notwendig, um die virale Pathogenese zu verstehen und klinisch relevante Biomarker zu identifizieren. Beim Menschen ist die pulmonale Wirtsreaktion während des Krankheitsausbruchs jedoch noch immer kaum verstanden. Hier verwendeten wir einen räumlichen Transkriptomatlas, um pulmonale Mikrostruktur-spezifische COVID-19-Gensignaturen während der akuten Phase der Lungeninfektion bei Javaneraffen zu identifizieren. Die angeborene Immunantwort auf den virusinduzierten Zelltod war hauptsächlich in den Alveolarregionen aktiv, an denen die Infiltration aktivierter Makrophagen beteiligt war. Entzündete Gefäßregionen zeigten eine deutliche Hochregulierung der Interferon- und Komplement-Signalweg-Gene, die die antivirale Aktivität und die Reaktion auf Gewebeschäden vermitteln. Darüber hinaus wurden bekannte Biomarker-Gene in bestimmten Mikrostrukturen signifikant exprimiert, und einige von ihnen wurden universell in allen Mikrostrukturen exprimiert. Diese Ergebnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, die wichtigsten Treiber des Krankheitsverlaufs und klinisch anwendbare Biomarker zu identifizieren, indem man sich auf pulmonale Mikrostrukturen konzentriert, die während einer SARS-CoV-2-Infektion auftreten.

Das Virus des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS-CoV-2), das die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) verursacht, hat in den letzten Jahren eine globale Pandemie angeheizt1,2. Obwohl die Entwicklung wirksamer Impfstoffe die Bedrohung von COVID-19 für Endemiegebiete verringert hat, stellen das Auftreten neuer Varianten und die Möglichkeit einer erneuten Infektion bei genesenen Patienten weiterhin eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Das Krankheitsspektrum von COVID-19 reicht von einer asymptomatischen Infektion bis zum akuten Atemnotsyndrom (ARDS), das häufig mit einer Immunschwäche und einem „Zytokinsturm“3 einhergeht. Insbesondere Patienten mit ARDS weisen diffuse Alveolarschäden auf, die zu Lungenödemen und Ateminsuffizienz führen. In schweren Fällen kommt es auch zu vaskulärer Endothelialitis und Thrombose4. Darüber hinaus können Patienten mit einer SARS-CoV-2-Infektion einen komplexen Krankheitsverlauf mit unterschiedlichen Mustern pathologischer Veränderungen im Epithel- und Gefäßgewebe aufweisen, die gelegentlich als einzelnes Muster oder beide Muster gleichzeitig auftreten5. Daher ist eine umfassende histopathologische Untersuchung erforderlich, um diese Krankheit vollständig zu verstehen und zu behandeln.

Die Definition einer Wirtsreaktion auf SARS-CoV-2 auf molekularer Ebene ist notwendig, um die virale Pathogenese zu verstehen und klinische Biomarker zu identifizieren. Mithilfe der Einzelzell- oder Massen-RNA-Sequenzierung ist es möglich, die Prognose bei leichten und schweren Patienten vorherzusagen und Personen mit einem hohen Infektionsrisiko zu untersuchen6,7. Diese Ergebnisse wurden jedoch durch Tests von Nasenabstrichen und Blutproben ermittelt; Daher ist unklar, ob virusbedingte Gewebeschäden – das Ziel der klinischen Behandlung – mit solchen Methoden genau widergespiegelt werden. Insbesondere haben die jüngsten Fortschritte in der räumlichen Transkriptomik Studien zur Wirtsreaktion auf ein Virus mit Einzelzellauflösung ermöglicht, ohne topologische Informationen zu verlieren. Das räumlich aufgelöste Transkriptom der mit SARS-CoV-2 infizierten menschlichen Lunge hat gezeigt, dass das Virus Alveolarepithelzellen infiziert und an der Infektionsstelle eine lokalisierte Hyperinflammation auslöst8,9. In einer früheren Studie wurde eine intrapulmonale Heterogenität der Wirtsreaktion auf eine SARS-CoV-2-Infektion beim Menschen festgestellt, insbesondere im Hinblick auf die Interferonreaktion, die von der Virusverteilung abhängt10. Darüber hinaus wurden gewebetypspezifische Reaktionen auf SARS-CoV-2 identifiziert, mit einer deutlichen Expression von Genen, die mit der Aktivierung von Makrophagen, Zytokinwegen und Komplementaktivierung in Alveolen, großen Atemwegen bzw. Blutgefäßen assoziiert sind11.

Frühere Versuche, die virale Pathogenese mittels räumlicher Transkriptomanalyse aufzuklären, wurden mit Proben verstorbener Patienten durchgeführt, die einer schweren Infektion erlegen waren. Da Autopsieproben jedoch im Endstadium der Krankheit entnommen werden, ist das Verständnis des Mechanismus des Krankheitsverlaufs in früheren Infektionsstadien begrenzt. Darüber hinaus ist bei der Interpretation der Ergebnisse klinischer Studien Vorsicht geboten, da es bei einer SARS-CoV-2-Infektion viele Störfaktoren gibt, einschließlich einer bereits bestehenden Wirtsimmunität12,13. Nichtmenschliche Primaten (NHPs), die phylogenetisch die dem Menschen am nächsten stehenden Tiere sind, werden häufig als Tiermodelle verwendet, um die Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten gegen SARS-CoV-2 zu bewerten oder die Pathogenität neu auftretender besorgniserregender Varianten zu identifizieren. Solche Modelle sind für die Forschung an menschlichen Patienten unerlässlich, da sie nicht nur den Weg und die Menge der Virusinfektion bestimmen können, sondern auch die Möglichkeit einer Längsschnittprobeentnahme entsprechend dem Forschungszweck bieten. Daher sind räumliche Transkriptomstudien unter Verwendung eines ausgefeilten NHP-Modells erforderlich, um den zugrunde liegenden Mechanismus der SARS-CoV-2-Infektion besser zu verstehen.

In dieser Studie präsentieren wir einen gesamten Transkriptomatlas der SARS-CoV-2-infizierten Cynomolgus-Makaken-Lunge, der mit der Nanostring GeoMX-Technologie erstellt wurde. Die ortsaufgelösten transkriptomischen Profile aus Lungengewebe bestätigten die Ausprägung der Wirtsreaktion am Ort der Virusinfektion, und diese Reaktion stand in direktem Zusammenhang mit einer Gewebeschädigung. Ziel der Studie war es, die Pathogenese einer frühen SARS-CoV-2-Infektion aufzuklären, indem die Expressionsmuster der Wirtsreaktion auf das Virus anhand der Mikrostruktur der Lunge klassifiziert wurden.

Histopathologische Untersuchungen wurden an der Lunge von SARS-CoV-2 und scheininfizierten Javaneraffen durchgeführt. Diese Lungen wurden in sechs Lappen unterteilt (linker oberer, linker mittlerer, linker unterer, rechter oberer, rechter mittlerer und rechter unterer Lappen) und pathologische Veränderungen in den Alveolen, Bronchiolen und Blutgefäßen wurden für jeden Lappen beurteilt. In den virusinfizierten Lungenlappen war eine diffuse Alveolarschädigung eine typische Läsion, die durch eine Verdickung der Alveolarwand, Epithelschäden und Proteinose gekennzeichnet war. Es wurde festgestellt, dass verschiedene Entzündungszellen, darunter Neutrophile, Lymphozyten und Makrophagen, in die beschädigten Alveolen infiltriert waren. Darüber hinaus wurden bei stark geschädigten Lungenlappen Lungenödeme und hyaline Membranbildungen beobachtet. Gleichzeitig wurde eine bronchioläre Epitheldegeneration mit einer mononukleären Zellinfiltration beobachtet. Neutrophile neigten dazu, weniger zu infiltrieren als mononukleäre Zellen, waren jedoch häufig mit Exsudaten in stark geschädigten Bronchiolen vorhanden. Eine peribronchioläre entzündliche Manschette wurde multifokal beobachtet, jedoch nicht in mehreren Lungenlappen. Gefäßendothelschäden wurden gleichzeitig mit der intravaskulären Infiltration von Neutrophilen und mononukleären Zellen beobachtet und gingen häufig mit einer perivaskulären Entzündung einher (Tabelle 1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SARS-CoV-2 akute Läsionen in den Alveolar-, Bronchiolar- und Gefäßregionen der Lunge des Javaneraffes hervorruft, was auf eine schwere COVID-19-Infektion hinweist.

NanoString GeoMx wurde verwendet, um eine räumliche transkriptomische Analyse von Lungengewebe durchzuführen, das von experimentell infizierten Tieren gewonnen wurde (Abb. 1). Die räumliche Transkriptionsprofilierung des Ziel-ROI wurde durch die Verteilung des SARS-CoV-2-Nukleokapsids gesteuert. Virusinfizierte Lungenlappen zeigten ein starkes Signal für virales Nukleokapsid, wohingegen scheininfizierte Lungenlappen kein IHC-Signal zeigten. Die positiven Signale wurden hauptsächlich in Typ-2-Pneumozyten und Makrophagen und gelegentlich in bronchiolären Epithelzellen nachgewiesen. Darüber hinaus wurden die ROIs auf seriellen Schnitten ausgewählt, die mit dem Epithelzellmarker PanCK, dem Immunzellmarker CD45 und dem Makrophagenmarker CD68 zusammen mit der Syto13-DNA-Nukleinsäurefärbung sichtbar gemacht wurden. Die Ziel-ROIs wurden dann in drei große Lungenstrukturen eingeteilt: alveoläre, bronchioläre und vaskuläre ROIs. Insgesamt wurden für jeden Makaken 12 ROIs (4 für jeden strukturellen ROI) ausgewählt. Insgesamt wurden 36 ROIs aus virusinfizierten Makaken ausgewählt. In ähnlicher Weise wurden 36 ROIs in den Lungenlappen von scheininfizierten Makaken ausgewählt, die eine normale Morphologie aufwiesen (Abb. 2).

Mit SARS-CoV-2 infizierte Gewebeschnitte wurden hergestellt und eine Immunhistochemie unter Verwendung der Gewebemorphologiemarker durchgeführt. Die Gewebeträger wurden dann mit Sonden aus dem Human Whole Transcriptome Atlas hybridisiert. Anschließend wurden sie auf den digitalen GeoProfiler GeoMx geladen. Nach Auswahl der Region of Interest (ROI) wurden Oligos aus den hybridisierten Sonden durch photospaltendes UV-Licht freigesetzt und in einer 96-Well-Platte abgelagert. Schließlich wurden Sequenzierungsbibliotheken erstellt und die anschließende Sequenzierung und Zählung durchgeführt.

Die Gewebemorphologie wurde mit dem Epithelzellmarker PanCK (grün), dem Immunzellmarker CD45 (gelb) und dem Makrophagenmarker CD68 (rot) zusammen mit der Färbung der Syto13-DNA-Nukleinsäure (blau) sichtbar gemacht. Gewebemikrostrukturen wurden als Pfeil gekennzeichnet; Alveolar, Sternchen; Bronchiolar und Pfeilspitze; Gefäß-ROIs. IHC weist auf eine DAB-Markierung (braun)-Immunhistochemie für SARS-CoV-2-Virusnukleinsäure hin. H&E weist auf eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung hin. Maßstabsleiste, SARS-CoV-2 geringe Vergrößerung; 500 μm und hohe Vergrößerung; 100 μm. Maßstabsleiste, vorgetäuschte geringe Vergrößerung; 500 μm und hohe Vergrößerung; 200 μm.

Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde als Methode zur Reduzierung der Datendimensionalität verwendet, um biologische Faktoren zu identifizieren, die Variabilität im räumlichen Transkriptom verursachen. Bei der gemeinsamen Analyse aller ROIs unterschieden PC1 und PC2 bronchioläre ROIs von anderen strukturellen ROIs (Abb. 3a). Darüber hinaus wurden vaskuläre ROIs bei der Darstellung von PC1 und PC3 von anderen strukturellen ROIs getrennt (Abb. 3b). Die Diagramme von PC2 und PC3 könnten alveoläre, bronchioläre und vaskuläre ROIs gruppieren (Abb. 3c). Bemerkenswerterweise ergab eine Darstellung alveolärer ROIs auf PC1 und PC2, dass SARS-CoV-2-infizierte ROIs klar von scheininfizierten ROIs getrennt waren (Abb. 3d). Im PCA-Diagramm der bronchiolären ROIs überlappten mehrere scheininfizierte ROIs mit SARS-CoV-2-infizierten ROIs in PC1 und PC2 (Abb. 3e). Gefäß-ROIs wurden durch SARS-CoV-2-infizierte ROIs und scheininfizierte ROIs in Diagrammen von PC1 und PC3 gruppiert (Abb. 3f). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass strukturelle Heterogenität mit dem dominanten Zelltyp mit Variabilität im räumlichen Transkriptom und durch SARS-CoV-2-Infektionen verursachten Transkriptionsveränderungen in jedem gezielten strukturellen ROI verbunden ist.

PCA-Diagramme stellen alle (a–c), alveolären (d), bronchiolären (e) und vaskulären (f) ROIs dar, die aus SARS-CoV-2 und scheininfizierten Lungen ausgewählt wurden. Jede Gruppe und jeder mikrostrukturelle ROI werden mit einer anderen Farbe bzw. Markierung dargestellt. Der normalisierte Anreicherungsscore (NES) wird als Balkendiagramm dargestellt und angepasste p-Werte werden durch einen Farbverlauf (g) dargestellt. Die schwarze Farbe weist auf Nicht-Signifikanz hin.

Wir führten eine GSEA durch, um den zugrunde liegenden biologischen Prozess zu identifizieren, der mit jedem strukturellen ROI verbunden ist, indem wir das Anreicherungs- oder Verarmungsmuster von Gensätzen bestätigten, die nach ihren Funktionswegen gruppiert waren. Erstens fanden wir im alveolären ROI eine signifikante Anreicherung von Gensätzen, einschließlich der Entzündungsreaktion, der Interferon-Gamma-Reaktion, der Interferon-Alpha-Reaktion, der TNF-Alpha-Signalisierung durch NFkB, der TGF-Beta-Signalisierung, der IL2-STAT5-Signalisierung und der IL6-JAK-STAT3-Signalisierung , Komplement, Apoptose, Hypoxie, reaktiver Sauerstoffspezies-Weg und p53-Weg. Zweitens gab es in bronchiolären ROIs eine signifikante Anreicherung der Gensätze, einschließlich der Interferon-Gamma-Reaktion, der Interferon-Alpha-Reaktion, der TGF-Beta-Signalisierung, des Komplements, der Apoptose, der Hypoxie, des Signalwegs für reaktive Sauerstoffspezies und des p53-Signalwegs. Schließlich gab es in vaskulären ROIs eine signifikante Anreicherung der Gensätze, einschließlich der Entzündungsreaktion, der Interferon-Gamma-Reaktion, der Interferon-Alpha-Reaktion, der TNF-Alpha-Signalisierung durch NFkB, der TGF-Beta-Signalisierung, der IL2-STAT5-Signalisierung, der IL6-JAK-STAT3-Signalisierung, der Koagulation, Komplement, Apoptose, Hypoxie, reaktiver Sauerstoffspezies-Weg, p53-Weg und Angiogenese (Abb. 3g). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die angereicherten Genwege, die an den Zytokin- und Zellschädigungsreaktionen gegen das Virus beteiligt sind, je nach Art der Gewebestruktur variieren. Insbesondere stellten wir fest, dass die Entzündungsreaktion sowie die TNF-alpha- und IL-Signalwege in alveolären und vaskulären ROIs stärker ausgeprägt waren als in bronchiolären ROIs. Darüber hinaus kam es zu einer signifikanten Hochregulierung der mit der Koagulation und Angiogenese verbundenen Signalwege in vaskulären ROIs.

Signifikante DEGs zwischen SARS-CoV-2 und scheininfizierten ROIs wurden entsprechend dem funktionell beteiligten Genweg in jedem strukturellen ROI klassifiziert. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von GSEA fanden wir eine signifikante Co-Upregulation von Genen, die mit der Interferon-Reaktion in Zusammenhang stehen (B2M, DDX60, PSMB8, PSMB9, PSME2 und STAT2) in alveolären, bronchiolären und vaskulären ROIs. Darüber hinaus waren ADAR, CMPK2, DHX58, HERC6, IFI35, IFI44, IFIH1, IFIT3, ISG15, LAP3, PSMB9, PSME1, RSAD2 und TAP1 in alveolären ROIs signifikant hochreguliert. Es kam zu einer selektiven Expression von Genen, die an TNF- und Interleukin-Signalwegen in alveolären und vaskulären ROIs beteiligt sind. Bei DEGs, die über NFkB an der TNF-alpha-Signalübertragung beteiligt sind, wurden CCL2, CDKN1A, DDX58, EGR1, FOS, IER3, IFIH1, NFKB1, NINJ1, SAT1 und SOD2 nur in alveolären und vaskulären ROIs hochreguliert. Bei DEGs, die an der IL2-STAT5-Signalübertragung beteiligt sind, waren CTSZ und FGL2 in alveolären und vaskulären ROIs signifikant hochreguliert. Auch CAPG, CD48, IL10RA, IRF8, ITGAV, MAPKAPK2 und SLC39A8 waren nur in alveolären ROIs signifikant hochreguliert. Bei DEGs, die an der IL6-JAK-STAT3-Signalübertragung beteiligt sind, waren CSF2RB, GRB2, STAT1, STAT2 und TNFRSF21 in alveolären und vaskulären ROIs signifikant hochreguliert. Außerdem waren CSF3R und TNFRSF12A nur in alveolären ROIs signifikant hochreguliert (Abb. 4). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Lunge in der frühen SARS-CoV-2-Infektion diskrete regionale Transkriptionsprofile aufweist, die mit der Zytokinreaktion auf das Virus verbunden sind. Insbesondere identifizierte unsere Analyse Gensignaturen, die mit der Interferon-Reaktion in allen drei strukturellen ROIs verbunden sind, wobei die TNF-alpha- und IL-Signalwege in alveolären und vaskulären ROIs selektiv verstärkt wurden.

Die normalisierten Q3-Zählungen sind in einem Blau-Rot-Farbverlauf gefärbt. Jede Gruppe und jeder mikrostrukturelle ROI werden mit einer anderen Farbe dargestellt.

In Übereinstimmung mit den GSEA-Ergebnissen kam es zu einer signifikanten Hochregulierung der mit der Entzündungsreaktion in Zusammenhang stehenden Gene (TAPBP und TIMP1) in alveolären und vaskulären ROIs. Darüber hinaus waren CCL2, CD48, CDKN1A, CSF3R, CYBB, EMP3, GNA15, IL10RA, LYN, MMP14, MSR1, NFKB1, OLR1 und PTPRE in alveolären ROIs signifikant hochreguliert. Es kam zu einer selektiven Expression von Genen, die an Gerinnungs-/Komplementwegen in alveolären und vaskulären ROIs beteiligt sind. CTSB, LGMN und TIMP1 waren in alveolären und vaskulären ROIs signifikant hochreguliert. Außerdem waren C1QA, C3, DUSP6, FN1, MMP14, OLR1 und SERPINA1 nur in alveolären ROIs signifikant hochreguliert, wohingegen CFB und SERPING1 nur in vaskulären ROIs signifikant hochreguliert waren. Bei DEGs, die an der Angiogenese beteiligt sind, waren COL3A1, TIMP1 und TNFRSF21 in vaskulären ROIs hochreguliert. Alle drei mikrostrukturellen ROIs zeigten eine Hochregulierung der zellulären Schadensreaktion mit hoher Expression von Genen, die mit Apoptose (SAT1 und TIMP1), Hypoxie (ENO1, PLAC8 und TGFBI), reaktiven Sauerstoffspezies (LSP1, PRDX1 und SOD2) und p53 (FOS) angereichert sind und IFI30) Pfade. Bemerkenswert ist, dass diese Gene, die auf Zellschäden hinweisen, überwiegend in alveolären ROIs exprimiert wurden (Abb. 4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DEGs, die an der zellulären Schadensreaktion auf Viren beteiligt sind, je nach Gewebemikrostruktur variieren. Wir fanden Gensignaturen, die mit Apoptose, Hypoxie und reaktiven Sauerstoffspezies sowie p53-Signalwegen in allen drei mikrostrukturellen ROIs assoziiert sind. Darüber hinaus fanden wir eine selektive Hochregulierung der Entzündungsreaktionswege sowohl in alveolären als auch vaskulären ROIs.

Wir haben außerdem einen Gensignatur-Biomarker entwickelt, der jeder Gewebemikrostruktur zugeordnet ist. Unabhängig vom ROI der Gewebestruktur kam es in der COVID-19-Lunge zu einer konsistenten Hochregulierung der Gene, einschließlich B2M, DDX60, HLA-B, PSMB8, PSMB9, PSME2, ​​STAT1, STAT2 und TNFRSF21. Eine Hochregulierung von Genen wie ANXA5, ISG20, MAPKAPK2, PRDX5, S100A10, SAT1 und SERPINA1 war in alveolären und bronchiolären ROIs erkennbar. Außerdem wurde die Hochregulierung von Genen wie ANXA1, ATOX1, CD74, CSF2RB, CTSB, CTSZ, FCER1G, FGL2, GRB2, HLA-DRB1, IFI27, IFI30, IFI44L, LGALS3BP, LGMN, LSP1, TIMP1 und ZNFX1 beobachtet in alveolären und vaskulären ROIs. Für alveoläre ROIs waren C3, CAPG, CCL2, CTSC, DDX58, ENO1, FOS, GZMB, IFI44, IFIT1, IFIT3, IRF8, ISG15, LIPA, OLR1, PLAC8, PRDX1, RSAD2, SOD2 und TGFBI signifikant hochreguliert (fach- Änderung von >3 gegenüber Schein). Bei den bronchiolären ROIs waren CD55, ISCU, MVP, PPP1CA, RABGAP1L, ST14 und TGM2 signifikant hochreguliert (Fachveränderung von >2 gegenüber Schein). Für die vaskulären ROIs waren CFB, SERPING1 und TAPBP signifikant hochreguliert (Fachänderung von >2 gegenüber Schein) (Abb. 5). Diese in alveolären, bronchiolären und vaskulären ROIs beobachteten Gensignaturen weisen auf die Möglichkeit hin, mikrostrukturspezifische Biomarker für akute SARS-CoV-2-Infektionen zu identifizieren.

ein Venn-Diagramm mikrostrukturspezifischer COVID-19-DEGs (im Vergleich zu simuliertem, angepasstem P-Wert < 0,05 und einer absoluten log2-fachen Änderung >1). Vulkandiagramm, das alveoläre (b), bronchioläre (c) und vaskuläre (d) spezifische COVID-19-DEGs zeigt (im Vergleich zum simulierten, angepassten P-Wert < 0,05 und einer absoluten log2-fachen Änderung >1).

In der vorliegenden Studie verwendeten wir die Analyse des räumlichen Transkriptomatlas, um pulmonale Mikrostruktur-spezifische COVID-19-Gensignaturen in der Lunge von Cynomolgus-Makaken zu identifizieren, die experimentell mit SARS-CoV-2 infiziert waren. Die konventionelle Histopathologie bestätigte, dass dieses nichtmenschliche Primatenmodell den Phänotyp von Patienten mit schwerem COVID-19 darstellt, basierend auf der Tatsache, dass Läsionen wie diffuse Alveolarschäden, bronchioläre Entzündungen und vaskuläre Endotheliitis in diesem Modell deutlich beobachtet wurden. Wir führten eine räumliche transkriptomische Analyse der wichtigsten Lungenmikrostrukturen durch, in denen diese Läsionen auftraten, einschließlich der Alveolen, Bronchiolen und Blutgefäße. Die Zytokin- und Zellschädigungsreaktionen waren in den Alveolar- und Gefäßregionen robuster als in den Bronchiolarregionen. Bemerkenswerterweise fanden wir in jeder Mikrostruktur signifikante Unterschiede in der Expression von Genen, die mit dem Interferon-Weg für die antivirale Aktivität, dem Komplementsystem und dem Entzündungsweg, der Gewebeschäden vermittelt, assoziiert sind. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass klinisch relevante Biomarker, die zuvor in Blut- oder bronchoalveolären Lavageflüssigkeitsproben (BALF) von Patienten mit schwerer COVID-19-Erkrankung identifiziert wurden, selektiv in spezifischen Lungenmikrostrukturen exprimiert wurden. Insbesondere wurden mehrere Gene als Biomarker vorgeschlagen, die unabhängig von der Art der Mikrostruktur universell exprimiert werden. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass COVID-19-Signaturgene wie IFI27 – zuvor als räumlicher Transkriptionsbiomarker zur Unterscheidung zwischen SARS-CoV-2 und Influenza-Infektionen bei menschlichen Patienten14 identifiziert – in der Lunge eines akuten Makaken-Infektionsmodells deutlich hochreguliert waren.

Wir fanden drei Muster pulmonaler histopathologischer Veränderungen bei SARS-CoV-2-infizierten Javaneraffen, die teilweise mit denen von COVID-19-Patienten übereinstimmen5. Allerdings wurde in diesem Makakenmodell mit akuter Infektion kein fibrotisches Muster beobachtet, das sich bei Patienten im Spätstadium der Krankheit entwickelte. Insbesondere wurde im Alveolarbereich eine diffuse Alveolarschädigung beobachtet, die durch ein Alveolaödem und eine hyaline Membran gekennzeichnet war. Bisher wurden pathologische Veränderungen im Bronchiolenbereich unterschätzt; Wir beobachteten jedoch klare Muster einer bronchiolären Epitheldegeneration und -entblößung mit entzündlicher Zellinfiltration. Darüber hinaus wurden bei Endothelialitis bei Javaneraffen Gefäßveränderungen beobachtet, die möglicherweise ein wesentlicher Faktor für das Fortschreiten einer schweren Erkrankung sind4. Diese pathologischen Befunde wurden durch Veränderungen der Zellmarker-Genexpression in der virusinfizierten Lunge weiter bestätigt. AGER und Surfactant Protein C (SFTPC), die funktionelle Genmarker von Alveolarepithelzellen vom Typ I bzw. Typ II sind15, wurden in der virusinfizierten Alveolarregion herunterreguliert. Darüber hinaus wurde das Mucin-Gen MUCL3 sowohl im Alveolar- als auch im Bronchiolarbereich herunterreguliert. Die Keratin-Gene KRT14, KRT35 und KRT77 waren im Alveolarbereich und KRT35 im Bronchiolenbereich herunterreguliert. Im Gegensatz dazu war der Makrophagenzellmarker CD163 im Alveolarbereich deutlich hochreguliert und CD68 war sowohl im Alveolar- als auch im Gefäßbereich hochreguliert. Diese Ergebnisse deuten auf einen geringeren Anteil an Alveolar- und Bronchiolenauskleidungszellen im Gegensatz zu Entzündungszellen in der Lunge von mit SARS-CoV-2 infizierten Javaneraffen hin, was auf einen Verlust der normalen Gewebefunktion hinweist. Obwohl fibrotische Veränderungen bei der H&E-Färbung nicht auffällig waren, waren mehrere Gene, die an der Kollagen- und Proteinanheftung beteiligt sind (z. B. COL3A1, CTSA, CTSB und CTSC), in alveolären und vaskulären ROIs signifikant hochreguliert, und dieser Befund stimmt mit dem eines früheren Makaken überein studieren16. Dies weist auf eine frühe Aktivierung fibrotischer Bahnen im infizierten Lungenparenchym hin.

In der vorliegenden Studie wurden die Transkriptome der ausgewählten ROIs anhand der Gewebemikrostruktur und dem Vorliegen einer Virusinfektion unterschieden. Der Mikrostrukturtyp der ROIs war der wichtigste biologische Faktor, der das räumliche Transkriptom im PCA-Diagramm abgrenzte. Dies kann auf unterschiedliche vorherrschende Zelltypen in jeder Mikrostruktur zurückgeführt werden und wird durch frühere Studien gestützt, in denen Transkriptionsprofile zwischen Geweben unterschieden wurden, die von bronchiolären Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und Typ-2-Pneumozyten dominiert werden14. Darüber hinaus induzierte die SARS-CoV-2-Infektion transkriptomische Veränderungen in allen drei strukturellen ROIs; Allerdings schienen einige bronchiale ROIs unabhängig von der Infektion ein ähnliches Transkriptom aufzuweisen, wie es bei PCA beobachtet wurde. Das Vorhandensein unterschiedlicher Muster von Gewebestrukturen kann auf die nachfolgenden GSEA-Ergebnisse zurückgeführt werden. Eine signifikante Anreicherung des Gensatzes, der an der Zytokin-Reaktion (Interferon, TNF-Alpha, TGF-BETA, IL2-STAT5 und IL6-JAK-STAT3) und der Reaktion auf Zellschäden (Entzündung, Koagulation, Komplement, Apoptose, Hypoxie, reaktiv) beteiligt ist Sauerstoffspezies und p53) wurden sowohl in virusinfizierten alveolären als auch vaskulären ROIs im Vergleich zu den entsprechenden scheininfizierten ROIs beobachtet. Es gab jedoch keine signifikante Anreicherung mehrerer Gensätze, die an der Zytokinreaktion (TNF-Alpha, IL2–STAT5 und IL6–JAK–STAT3) oder der Zellschädigungsreaktion (Entzündung und Koagulation) in virusinfizierten bronchiolären ROIs beteiligt sind. Bei Patienten, die an COVID-19 starben, kam es vor allem in der Region der großen Atemwege zu einer Hochregulierung der Interferon- und Zytokin-bezogenen Genwege11; Allerdings war die Hochregulierung bei Makaken in den Alveolar- und Gefäßregionen signifikanter. Diese Diskrepanz kann auf den akuten Infektionsphänotyp des Makakenmodells zurückgeführt werden; Daher kann der Schluss gezogen werden, dass die Immunantwort des Wirts auf virusinduzierte Zellschäden während des Krankheitsausbruchs im Frühstadium einer akuten Infektion eher in den Alveolar- und Gefäßregionen als in der Bronchiolarregion robust ist. Weitere Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der Infektion sind erforderlich, um zusätzliche Einblicke in die dynamische Natur der Wirtsreaktion in bestimmten Lungenmikrostrukturen zu gewinnen. Darüber hinaus wurden in dieser Studie nur weibliche Tiere verwendet, sodass bei der Interpretation von Immunantwortprofilen im Zusammenhang mit der Geschlechtsprädilektion Vorsicht geboten ist. Bei menschlichen Patienten wurde über eine stärkere T-Zell-Aktivierung bei Frauen berichtet, und es wurde vermutet, dass T-Zell-Reaktionen und angeborene Immunzytokine bei Patienten mit COVID-1917 zu einem unterschiedlichen Krankheitsverlauf je nach Geschlecht beitragen.

In Übereinstimmung mit den PCA- und GSEA-Ergebnissen wurde die Heterogenität der Lungenmikrostruktur bei der Expression von Genen bestätigt, die mit der Zytokinreaktion, insbesondere der Interferon (IFN)-Reaktion, zusammenhängen. Normalerweise ist die IFN-Reaktion zum Schutz vor einer Virusinvasion erforderlich, ihre fehlerhafte Aktivierung führt jedoch zur Überproduktion entzündungsfördernder Zytokine, was zu einer Schädigung des Wirtsgewebes führt18. Hunderte von Interferon-stimulierten Genen (ISGs) sind an der IFN-Reaktion des Wirts beteiligt, ihre genauen Rollen sind jedoch noch nicht charakterisiert. Die erhöhte Expression von ISGs wurde nur in Lungenproben mit hohem SARS-CoV-2-Gehalt in den frühen Stadien der Infektion berichtet und war mit dem Ausbruch der Krankheit verbunden19. ISG15, das die Sekretion mehrerer proinflammatorischer Zytokine und Chemokine18 steigert, war im alveolären ROI deutlich hochreguliert. ISG20, das über die RNase-Aktivität20 antivirale Aktivitäten ausübt, wurde sowohl in alveolären als auch bronchiolären ROIs hochreguliert. IFI27, das möglicherweise als früher transkriptomischer Biomarker in den Blutproben von COVID-19-Patienten dient7,21, war in alveolären und vaskulären Regionen hochreguliert, insbesondere mit einer signifikant hohen Änderung der vaskulären ROIs. Interessanterweise wurde RABGAP1L, das die IFN-Reaktion auf verschiedene RNA-Viren verstärkt und den Viruseintritt durch Endozytose22 hemmt, im bronchiolären ROI stark exprimiert. Die Ergebnisse unserer Studie stützen das lokale Expressionsmuster von IFN-Antwortgenen, das der Virusverteilung in der Lunge entspricht10 und zeigen weiterhin, dass sich die hochregulierten IFN-Signalweggene aufgrund der Mikrostruktur im virusinfizierten Bereich unterschieden. Die Ursache dieser Heterogenität der Genexpression des IFN-Signalwegs in der Lungenmikrostruktur während einer Virusinfektion ist unbekannt; Diese Heterogenität kann jedoch zur intrapulmonalen ungleichmäßigen Verteilung von SARS-CoV-2 beitragen.

Mehrere mit Entzündungen assoziierte Gene, die zuvor als Biomarker für schweres COVID-19 galten, wurden basierend auf der Lungenmikrostruktur selektiv hochreguliert. Der Chemokinligand 2 (CCL2), auch als Monozyten-Chemoattraktivprotein 1 (MCP1) bezeichnet, ist an der Rekrutierung von entzündlichen Monozyten oder Makrophagen23 beteiligt, und S100A10 aus der S100-Kalzium-bindenden Proteinfamilie ist an Entzündungen beteiligt, indem es die Plasminogenproduktion erhöht24. Die erhöhte Expression von Genen, die diese beiden Proteine ​​kodieren, wurde in BALF- bzw. Blutproben von Patienten mit schwerem COVID-1923,24 sowie im Alveolarbereich der Lunge von SARS-CoV-2-infizierten Makaken festgestellt. Diese Gene sind mit Signalwegen angereichert, die mit aktivierten Makrophagen assoziiert sind, was durch histopathologische Beobachtungen der intraalveolären und interstitiellen Makrophageninfiltration in der Lunge von Makaken weiter gezeigt wurde. Der Anstieg des Gewebeinhibitors der Metalloproteinase 1 (TIMP-1), der mit dem Vorhandensein hochaktivierter Neutrophilen verbunden ist, wurde in der Blutprobe von Patienten mit schwerer COVID-19-Erkrankung beobachtet25,26. In unserem akuten Infektionsmodell war das TIMP1-Gen in alveolären und vaskulären Regionen signifikant hochreguliert. Dies kann auf die intraalveoläre und vaskuläre Infiltration von Neutrophilen zurückgeführt werden, die im Frühstadium der Erkrankung beobachtet wurde. Bisher wurde angenommen, dass oxidativer Stress zur Sterblichkeit während einer SARS-CoV-Infektion beiträgt27. Gene, die auf oxidativen Stress reagieren, wie PRDX1 und FOS, waren im Blut rekonvaleszenter SARS-CoV-Patienten erhöht28. Von diesen ist Peroxiredoxin 1 (PRDX1) ein wirksamer Fänger reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und wurde als potenzielles Therapeutikum für SARS-CoV-2-Infektionen vorgeschlagen29. Diese beiden Gene waren im alveolären ROI deutlich hochreguliert, was darauf hindeutet, dass die Regulierung der Reaktion des ROS-Signalwegs auf Hypoxie ein wichtiger Mechanismus ist, der die Schwelle für eine irreversible Schädigung des Parenchymgewebes während einer SARS-CoV-2-Infektion bestimmen kann.

Gemeinsame Gensignaturen wurden in den Alveolar-, Bronchiolar- und Gefäßregionen der Lunge gefunden, wobei der Schwerpunkt auf der zellulären antiviralen Reaktion und der adaptiven Immunität lag. MHC-Klasse-1-Gene, einschließlich B2M und HLA-B, die eine Rolle bei der Antigenpräsentation, der Aktivierung zytotoxischer T-Zellen und NK-Zellen sowie dem Infektionsrisiko des Wirts spielen30,31, wurden in alveolären, bronchiolären und vaskulären ROIs hochreguliert. Darüber hinaus war DDX60 – ein kürzlich entdecktes Gen, das an der RIG-I-vermittelten Typ-I-Interferon-Reaktion und dem Nuklease-vermittelten viralen RNA-Abbauweg32 beteiligt ist – häufig hochreguliert. Die Proteasom-Untereinheiten vom β-Typ, PSMB8 und PSMB9, die an der intrazellulären Antigenverarbeitung33 beteiligt sind, wurden in allen drei strukturellen ROIs hochreguliert. STAT1 und STAT2, die die IFN-Antwort vom Typ I und Typ III vermitteln34, und TNFRSF21, ein Zelloberflächenrezeptor-Gen, das die JNK- und NF-kB-Signalwege aktiviert35, wurden ebenfalls in allen drei Regionen hochreguliert. Diese universellen Gene in allen Mikrostrukturen sind Schlüsselmediatoren der Wirtsreaktion auf SARS-CoV-2; Darüber hinaus überschneiden sie sich teilweise mit der stetigen Zunahme der Gene, die bei Patienten mit COVID-19 exprimiert werden, unabhängig von der Art des Gewebes11. Darüber hinaus sind diese gemeinsamen Signaturgene potenzielle Biomarker zur Validierung der Prognose oder direkte Ziele für die Immuntherapie. Beispielsweise werden die Gene, die für Proteasom-Untereinheiten kodieren, bei COVID-19-Patienten im hypoxischen Zustand überexprimiert, sind mit einer Abnahme der Lymphozytenzahl verbunden und korrelieren positiv mit klinischen Entzündungsmarkern36. In jüngsten klinischen Studien wurde versucht, den Zytokinsturm durch Regulierung des intrazellulären JAK/STAT-Signalwegs zu reduzieren37.

Da unklar ist, ob die kürzlich entdeckten Biomarker in bestimmten Mikrostrukturen eine schädliche oder schützende Rolle spielen, sind weitere Studien erforderlich, um die Rolle jedes Gens bei der Pathogenese von SARS-CoV-2 zu untersuchen. Da die in der vorliegenden Studie identifizierten Genprofile außerdem auf räumlichen Transkriptomdaten aus Regionen basierten, die sowohl infizierte als auch nicht infizierte Zellen enthielten, ist es notwendig, durch zusätzliche Einzelzell-RNA-Sequenzierung zwischen Zellen mit und ohne virale RNA zu unterscheiden, um zwischen viralen Infektionseffekten zu unterscheiden und Nebeneffekte. Da insbesondere Gefäßregionen ohne virales Antigen ebenfalls deutliche Läsionen aufwiesen, wie in einer früheren Studie16 beschrieben, bedarf der direkte Zusammenhang zwischen Läsionen und der Virusreplikation in Endothelzellen weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus gab es Einschränkungen hinsichtlich der Kreuzreaktivität zwischen menschlicher WTA-Sonde und Makaken-RNA-Zielen, wir fanden jedoch heraus, dass die meisten Sonden eine Identität von >90 % mit ihren am besten übereinstimmenden Zielen (n = 16.201) aufwiesen und genügend Signal lieferten, um nachgewiesen zu werden. wie in früheren Studien zu anderen Arten berichtet38. Das Endergebnis der räumlichen Transkriptomanalyse wird durch die Anzahl der freigesetzten Oligos dargestellt, was Nicht-Pathologen bei der Quantifizierung von Genexpressionsdaten hilft. Für die Auswahl der ROIs für die Analyse ist jedoch ein histopathologischer Hintergrund erforderlich. Darüber hinaus ist beim Vergleich der Expression zwischen verschiedenen Gewebeproben eine sorgfältige Überlegung der Normalisierungsstrategie erforderlich, um Chargeneffekte zu reduzieren39. Trotz dieser Einschränkungen ist die räumliche Transkriptomik ein leistungsstarkes Werkzeug, das die Massen- oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung ergänzen kann, bei der topologische Informationen verloren gehen und auf die einmalige Analyse beschränkt sind. Bemerkenswert ist, dass dieser Studienansatz, der die Verwendung von FFPE-Gewebe beinhaltet, nicht nur auf neu präparierte Proben anwendbar ist, sondern auch auf Archivproben für diagnostische Zwecke.

Dies ist die räumliche transkriptomische Studie von COVID-19 unter Verwendung von NHPs, um den Weg und die Menge der Virusinfektion zu kontrollieren. Diese Studie reduzierte die in Autopsieproben menschlicher Patienten beobachtete Heterogenität erheblich und ermöglichte die Untersuchung der Wirtsreaktion auf eine akute SARS-CoV-2-Infektion während des anfänglichen Krankheitsverlaufs. Durch die Aufklärung der mikrostrukturspezifischen Wirtsreaktion liefern unsere Ergebnisse weitere Einblicke in die Pathogenese von COVID-19. Darüber hinaus haben wir neuartige Biomarker entdeckt, die für die Validierung von Wirtsrisikofaktoren und klinischen Prognosen nach einer SARS-CoV-2-Infektion notwendig sind. Weitere Studien zu Lungenmikrostruktur-spezifischen Wirtsreaktionen auf verschiedene Atemwegserreger und neu auftretende SARS-CoV-2-Varianten sind erforderlich.

Die Autoren bestätigen, dass die ethischen Richtlinien der Zeitschrift, wie auf der Seite mit den Autorenrichtlinien angegeben, eingehalten und von der zuständigen Ethikkommission genehmigt wurden. Die Richtlinien des US National Research Council für die Pflege und Verwendung von Labortieren wurden befolgt. Alle Tierversuche wurden vom KRIBB Institutional Animal Care and Use Committee (Genehmigungsnummer KRIBB-AEC-20064) genehmigt.

Für diese Studie wurden sechs weibliche Javaneraffen (Macaca fascicularis) kambodschanischer Herkunft im Alter zwischen 3 und 6 Jahren verwendet. Davon waren drei mit SARS-CoV-2 infiziert, während die restlichen drei zur Kontrollgruppe gehörten. Das Virus wurde jedem Makaken über mehrere Wege (intratracheal; 4 ml, oral; 5 ml, konjunktival; 0,5 ml, intranasal; 1 ml und intravenös; 2 ml) in einer Konzentration von 2,1 × 106 50 % infektiösen Gewebekulturdosen inokuliert /ml ([TCID50]/ml) in einem Volumen von 12,5 ml40,41. Die Kontrollgruppe wurde mit der gleichen PBS-Menge über die gleichen Verabreichungswege scheininfiziert. Drei Tage nach der Infektion (dpi) wurden alle Makaken eingeschläfert und obduziert; außerdem wurden ihre Atmungsorgane gesammelt. Diese Makaken wurden in Innenkäfigen im Tierlabor der Biosicherheitsstufe 3 (ABL-3) im Korea National Primate Research Center am Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) aufgezogen.

Das in dieser Studie verwendete SARS-CoV-2-Virus (Zugangsnummer NCCP43326) wurde von der National Culture Collection for Pathogens (Cheongju, Korea)40,41 bereitgestellt. Das Virus wurde aus einem koreanischen Patienten isoliert und vor der Verwendung dreimal in VERO-Zellen passagiert. Darüber hinaus wurde der Virustiter in VERO-Zellen mit der Reed-Münch-Methode bestimmt und als TCID50/ml ausgedrückt.

Vor der histopathologischen Untersuchung wurden die Lungen von Makaken in sechs Lappen unterteilt: den rechten oberen, den rechten mittleren, den rechten unteren, den linken oberen, den linken mittleren und den linken unteren. Aus einem konsolidierten Bereich jedes Lappens wurden Gewebeschnitte hergestellt und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Wenn der Konsolidierungsbereich visuell nicht erkennbar war, wurde derselbe Bereich, der bei den anderen Tieren identifiziert wurde, beprobt. Die histopathologische Untersuchung wurde anhand von Kriterien durchgeführt, die gegenüber denen zur Bestimmung histologischer Muster in klinischen Stadien von COVID-19-Patienten5 (Tabelle 1) modifiziert wurden.

Zur Bestätigung der Antigenverteilung in den Lungengewebeschnitten infizierter Makaken wurde eine Immunhistochemie (IHC) durchgeführt. Der IHC-Assay wurde mit einer zuvor beschriebenen Methode mit geringfügigen Modifikationen40 durchgeführt. Kurz gesagt, 4-μm-Schnitte wurden mit Xylol und Alkohol entparaffiniert und rehydratisiert und mit 3 % Wasserstoffperoxid behandelt, um endogene Peroxidase zu löschen. Die hitzeinduzierte Epitopgewinnung erfolgte unter Verwendung eines Zitronensäurepuffers mit pH 6. Die Gewebeschnitte wurden mit 4 % Rinderserumalbumin 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert und über Nacht bei 4 °C mit polyklonalen Kaninchenantikörpern gegen SARS-CoV-2-Nukleokapsid (Sino Biological), verdünnt 1:1000, inkubiert. Nach zwei Wäschen wurden die Objektträger 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit enzymkonjugiertem Sekundärantikörper inkubiert, mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB) sichtbar gemacht und mit Hämatoxylin gegengefärbt.

Das in einer früheren Studie beschriebene NanoString GeoMx-Verfahren wurde befolgt42. Es wurden formalinfixierte Paraffin-Einbettungsgewebeschnitte (FFPE) (4 μm) hergestellt und eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um die Lungenmorphologie unter Verwendung des Epithelzellmarkers PanCK (Novus, Klon AE1 + AE3) und des Immunzellmarkers CD45 (Novus, Klon 2B11) zu beurteilen + PD7/26) und dem Makrophagenmarker CD68 (Santa Cruz, Klon KP1) zusammen mit Syto13-DNA-Nukleinsäurefärbung. Die Gewebeschnitte wurden mit Sonden aus dem Human Whole Transcriptome Atlas hybridisiert, der auf mehr als 18.000 Gene abzielt. Die BLAST-Messung der %-Identität wurde verwendet, um die Kreuzreaktivität zwischen der Sonde und ihrem am besten passenden Ziel abzuschätzen, die in den Zusatzdaten 1 tabellarisch aufgeführt ist. Anschließend wurden sie auf den GeoMx DSP geladen. Die Auswahl der Region of Interest (ROI) erfolgte anhand der IHC-Färbung des Virus-Nukleokapsids in Serienschnitten. Oligos aus den hybridisierten Sonden wurden durch photospaltendes UV-Licht (385 nm) freigesetzt, das auf den ausgewählten ROI projiziert und in einer 96-Well-Platte abgelegt wurde. Nach dem Trocknen über Nacht wurden die Proben in mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser resuspendiert. Schließlich wurden Sequenzierungsbibliotheken erstellt und die anschließende Sequenzierung und Zählung mit dem Illumina NovaSeq6000 gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

LOQ wurde so eingestellt, dass Genausreißer erkannt werden. Der Grenzwert wurde durch das geometrische Mittel der negativen Sonden multipliziert mit dem Quadrat der geometrischen Standardabweichungen der negativen Sonden definiert, wie allgemein vom Hersteller empfohlen. Die Daten für jeden ROI, der LOQ-Filter passiert, wurden angepasst, um das gleiche 75. Perzentil (Q3) des RNA-Expressionssignals zu erreichen, indem eine Normalisierungsstrategie verwendet wurde, die im Allgemeinen für die Analyse ganzer Transkriptomdaten verwendet wird9,11. Kurz gesagt umfasste diese Methode die Schätzung des Q3 für die Genzahlen in jedem ROI, der dann auf den geometrischen Mittelwert des Q3 für alle ROIs normiert wurde. Darüber hinaus wurde eine Normalisierung unter Verwendung aller ausgewählten ROIs im selben Prozess durchgeführt. Die normalisierten Zählungen wurden in log2-Werte umgewandelt, die für nachfolgende Analysen verwendet wurden.

Um signifikante Trends und Muster in den Genexpressionsdatensätzen basierend auf dem experimentellen Design zu identifizieren, wurde PCA verwendet, um die Dimensionalität der Daten zu reduzieren. Diese Technik identifiziert die orthogonalen Dimensionen der Variabilität des Datensatzes und vereinfacht die Komplexität hochdimensionaler Daten durch Konvertierung in niedrigere Dimensionen. Die PCA schloss individuelle (Makaken-)Unterschiede und experimentelle (GeoMX-Scan) Chargenvariationen aus, die aus der transkriptomischen Analyse resultierten. Für die Analyse wurde das NanoString R-Paket verwendet.

Die Sequenzierungsdaten für die virus- und scheininfizierten ROIs wurden mithilfe von GSEA analysiert, um signifikante Assoziationen mit spezifischen Genpfaden zu identifizieren. Für die Analyse wurde das Softwarepaket GSEA 4.2.3 zusammen mit der Gensatzsammlung „HALLMARK“ (bestehend aus 50 Sätzen) verwendet, die aus der Datenbank für molekulare Signaturen (MSigDB Version 7.1) stammt. Für jeden Gensatz wurde ein normalisierter Anreicherungsscore (NES) berechnet und eine Falscherkennungsrate (FDR) < 0,05 wurde als signifikante Anreicherung angesehen. Alle Analysen wurden mit einer Gen-Set-Permutationszahl von 1000 durchgeführt.

DEGs zwischen SARS-CoV-2-infizierten ROIs und scheininfizierten ROIs wurden auf der Grundlage statistisch signifikanter Unterschiede ausgewählt (Benjamini-Hochberg-bereinigter P-Wert < 0,05 und eine absolute log2-fache Änderung > 1).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Rohdaten der räumlichen RNA-Sequenzierung sind im Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra; BioProject ID: PRJNA1002006) verfügbar. Die Quelldaten hinter den Grafiken in der Arbeit sind in Supplementary Data 2 verfügbar. Alle anderen in der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde vom koreanischen Ministerium für Wissenschaft und IKT (Fördernummer NBS7952211) und den Forschungsinitiativeprogrammen des Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) (Fördernummer KGM4572323) unterstützt. Die Autoren danken Enago (www.enago.co.kr) für die englischsprachige Rezension. Die Autoren danken außerdem E-biogen Inc. (Seoul, Korea) für die Unterstützung der GeoMx DSP-Plattform und NanoString Technologies, Inc. (Seattle, USA) für die Bereitstellung von Informationen zur Kreuzreaktivität menschlicher WTA-Sonden mit Makaken als ergänzende Daten.

National Primate Research Centre, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Cheongju, Chungcheongbuk, Republik Korea

Taehwan Oh, Green Kim, Seung Ho Baek, YoungMin Woo, Bon-Sang Koo, Eun-Ha Hwang, Kyuyoung Shim, You Jung An, Yujin Kim, Jinyoung Won, Youngjeon Lee und Jung Joo Hong

KRIBB School of Bioscience, Korea University of Science & Technology (UST), Daejeon, Republik Korea

YoungMin Woo, Kyuyoung Shim und Jung Joo Hong

Futuristic Animal Resource and Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Cheongju, Republik Korea

Kyung Seob Lim

Abteilung für Labortiermedizin, Hochschule für Veterinärmedizin, Seoul National University, Seoul, Republik Korea

Jae-Hak-Park

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TO und JJH analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. TO, GK, SHB, YW, BK, EH, KS, YJA, YK, JW, YL, KSL, JP und JJH führten die Experimente durch und verwalteten die Tiere. JJH war für das Konzept und Design der Studie verantwortlich.

Korrespondenz mit Jung Joo Hong.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Yasushi Itoh, Camilla Margaroli und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Karli Montague-Cardoso und Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Oh, T., Kim, G., Baek, SH et al. Der räumliche Transkriptomatlas enthüllt pulmonale Mikrostruktur-spezifische COVID-19-Gensignaturen bei Javaneraffen. Commun Biol 6, 879 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05253-8

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Eingegangen: 28. April 2023

Angenommen: 17. August 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05253-8

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